Музей древнерусской культуры и искусства расположен на территории Спасо-Андроникова монастыря, основанного в середине XIV века и связанного с Куликовской битвой и другими событиями русской истории и культуры. В древнейшем архитектурном памятнике Москвы, Спасском соборе (20-е годы XV века), в оконных проемах алтаря сохранились фрески Андрея Рублева, великого иконописца Древней Руси. В этом монастыре он был иноком и здесь же в 1430 г. был погребен.

До 1950 года в музее находился архив Министерства государственной безопасности. Когда Рублева официально признали великим русским художником, лучшего места для его музея было не найти. Указ о создании музея был принят советским правительством в 1947 г. в годовщину 800-летия Москвы.

Первоначально в фондах находились только копии и фотографии. Потом сюда стали поступать иконы, списанные по ветхости из провинциальных фондов, снятые со стен фрески. Сейчас в музее более 5 тысяч икон, и среди них есть работы Дионисия. Кроме иконного фонда, музей владеет собранием иконных окладов, литургических предметов, рукописных и печатных книг (в том числе - богослужебных и певческих старого обряда).